يتم التحدث حاليا عن الجهاز المخبري PCR للكشف عن الاصابة بفيروس كورونا Covid_19 فما هو هذا الجهاز :
تفاعل البوليميراز المتسلسل أو PCR و هو اختصار لكلمة الإنكليزية (بالإنجليزية: Polymerase chain reaction) هي طريقة مستخدمة بكثرة في البيولوجيا الجزيئية. يشتق اسمه من إحدى عناصره الأساسية وهو دنا بوليميريز أو بوليميراز الدي إن إيه و PCR هي عملية يحدث مضاعفة او مكاثرة لل DNA (تكوين نسخ عديدة من قطعة DNA) الحمض النووي من خلال تضاعف بواسطة إنزيم و تحدث في الوسط الصنعي. عندما يتطور التفاعل، فإن الحمض النووي المصنع يستخدم كقالب التضاعف. وذلك يُنشط تفاعل متسلسل والذي يحدث فيه تكبير أسي لقالب DNA. من الممكن، من خلال هذا التفاعل عمل ملايين النسخ لقطعة مفردة أو عدة قطع من ال DNA. يمكن تعديل تفاعل ال PCR من أجل استخدامه في العديد من المجلات مثل السلسلة والمكتبات الجينية والهندسة الوراثية.
تستخدم كل تطبيقات تفاعل البوليميريز المتسلسل إنزيم DNA polymerase مستقر حراريا، مثل تاك بوليمريز وهو إنزيم عزل من بكتريا المستحرة المائية وهي بكتيريا تعيش في المياه الينابيع الحارة. يعمل هذا الإنزيم على تجميع خيط دنا جديد من النيوكليوتيدات (مكعبات بناء الدنا)، وذلك باستعمال خيط دنا مفرد كقالب وقليلات النيوكليوتيدات (تسمى أيضا بوادئ الدنا) وهي مطلوبة لبدأ تصنيع الدنا. معظم طرق تفاعل البلمرة المتسلسل تستخدم التدوير الحراري بمعنى أنه يتم تسخين وتبريد عينة تفاعل البوليميريز المتسلسل وذلك طبقا لسلسلة خطوات حرارية محددة.
وضعت في عام 1983 من قبل كاري موليس ، والآن هذه التقنية لا يستغنى عنها في كثير من الأحيان ويتم استخدمها في مختبرات البحوث الطبية والبيولوجية لمجموعة متنوعة من التطبيقات وتشمل هذه استنساخ DNA المتسلسل المعتمدة على الحمض النووي , علم الوراثة العرقي ، أو التحليل الوظيفي من الجينات ، وتشخيص الأمراض الوراثية ، وتحديد بصمات الوراثية (المستخدمة في علوم الطب الشرعي و اختبار الأبوة )، وكشف وتشخيص الأمراض المعدية , في عام 1993، حصل على جائزة موليس على جائزة نوبل في الكيمياء مع مايكل سميث لعمله على PCR
الخطوات
تحسين التفاعل
يتم في بداية الأمر ادخال شريط DNA المراد مسخه مع البادئ (primers) وكذلك بوجود انزيم DNA polymerase والقواعد النتروجينه في انوبة صغيره تسمى eppender tube وتمر بثلاث مراحل متتالية :
مرحلة المسخ أو التفكك : وتحدث في درجة حرارة بين 94-98 م حيث يبدأ شريط DNA بالانقسام إلى خيطين منفصلين عن بعض وتحدث خلال فترة زمنية بين 1 - 9 دقائق
مرحلة الالتصاق : وفي هذه المرحلة يبدأ البادئ بالاتصاق على خيط DNA وتتم بدرجة حراريه اقل من مرحلة التفكك 50 - 65 ° س، وتتم تقريباً خلال 5 ثواني
مرحلة التمدد أو البناء : تعد هذه المرحلة الأخيرة في عملية المسخ وتحدث في درجة 75–80 °س، وهذه هي الدرجة الحرارية المناسبة لعمل الانزيم DNA polymerase لتقوم ببناء خيط الحامض النووي الجديد
هذه المراحل الثلاث تعتبر دوره واحد يصبح فيها الحامض قد تضاعف إلى نسختين ، ان اساس مبدأ عمل ال PCR هو الاعتماد على الدورة الحرارية التي تستخدم الديناميكا الحرارية من تفاعلات الحمض النووي عن طريق تناوب التسخين والتبريد لعينات ال PCR بعد تحديد درجات الحرارة . وهذه العملية تمكن من فصل فرعي الحمض النووي الحلزوني المزدوج في درجة حرارة عالية (DNA melting) وتحت درجات الحرارة المنخفضة فان كل فرع من الحمض النووي يستخدم بواسطة انزيمات بلمرة الحمض النووي لإنتاج تركيب جديد كامل منه. كل دورة من PCR تضم ثلاث عمليات مختلفة في دورة درجة الحرارة (( temperature cycling اولا التمسخ (denaturation) أو تذويب الحمض النووي حيث يفصل ال DNA الي قطعتين (ssDNA) من خلال كسر الرابطة الهيدروجينية بين ازواج القواعد . تعتبر هذه الخطوة قصيرة لانها تحتاج ما بين 10 ثانية و 30 ثانية في 92 درجة مئوية إلى 96 درجة مئوية . اما الخطوة الثانية الصلب: ( annealing) يتم صلب ال DNA الاولي لإنتاج سلاسل مكملة ل (ssDNA) من خلال تشكيل روابط هيدروجينية بالتالي ينتج اثنين من dsDNA جديد وهذه الأجزاء القصيرة تؤدي في نهايتها الي تشكيل الحمض النووي الجديد . اما الخطوة الثالثة الاستطالة (elongation) : وتسمى أيضا التكرار الانزيمي يتم فيها اتحاد ايونات موجبة كعامل محفز والكمية المطلوبة من مكملة ال deoxynucleotides (dNTPs) . وانزيم بلمرة ال DNAيبدا بتكرار ال DNA في الموقع التمهيدي . وتستمر هذه العمليات بإعادة تسخين ال dsDNA وفصله مرة أخرى .في كل دورة PCR يزداد جزء الحمض النووي زيادة أسية وفقا لاللأس 2 (يعني ان الواحد يصبح اثنان والاثنان أربعة ثم ثمانية…) .بما أن هذه العملية تستخدم لتضخيم الحمض النووي فان من 35 إلى 40 دورة نحتاجها لتقديم ما يكفي من عينة ال DNAللتحليل . بحتاج بوليمر الحمض النووي إلى محفز على شكل كيتونات ثنائية التكافؤ وهي اما المغنيسيوم أو المنغنيز . تستخدم هذه المحفزات أيضا كعامل مساعد في تفاعل البوليمرات المتسلسل . التركيز الطببيعي للمنغنيز هو 2.5 مايكرومتر . المشعلات هي أليغونيوكليوتايد (في PCR، وتستخدم أزواج التمهيدي) التي تمت إضافتها على شكل قطع مصنعة صغيرة من الحمض النووي والتي تحتوي على متتاليات مكملة للمنطقة المستهدفة لجزيء الحمض النووي المستهدف. المشعلات تصلب للجزء النهائي من التسلسل المستهدف ليتم تضخيمها. هذه المشعلات هي المكونات الرئيسية للتضخيم الانتقائي و المكرر لقطع الحمض النووي المستهدفة ضمن مجموعة من الأحماض النووية, و هي عادة ما تتكون من 20-25 من القواعد الطويلة, و ما لا يزيد عن 30 قاعدة طويلة. وتستخدم مجموعة معينة من المشعلات لتضخيم ناتج واحد من تفاعل البلمرة المتسلسل. واحدة من المشعلات يصلب إلى حبلا في الأمام والأخرى إلى الحبل العكسي من جزيئات الحمض النووي خلال خطوة الصلب. المشعلات انفسهم يتم تصنيعهم و تجميعهم غالبا من Phosphoramidites نيوكليوزيد مفرد, بطريقة تسلسل معين. هذه المشعلات بالتالي ترتبط بسهولة بالحمض النووي المكتمل والخاص بها, أو بجدائل الحمض النووي الريبي في تسلسل محدد, لتشكيل الدوبلكس, أو أقل في كثير من الأحيان, الهجينة لمرتبة أعلى. على هذا النحو، المشعلات لازمة لبدء تركيب الحمض النووي, وبالتالي فانها تسمح لبوليميريز الحمض النووي لتمديد أليغنوكليوتيد و تكرار حبلا التكميلية. بوليمبريزالحمض النووي يبدأ التكرار في 3'-نهاية التمهيدي، ويكمل حبلا المعاكس. والتمهيدي( المشعل) مع درجة الحرارة الصلب أعلى بكثير من درجة حرارة التفاعل الصلب مع درجة الحرارة الصلب أعلى بكثير من درجة حرارة التفاعل الصلب يمكن أن تفوت-hybridise وتمدد الحمض النووي في مكان غير صحيح على طول تسلسل الحمض النووي ، بينما عند درجة حرارة أقل بكثير من درجة حرارة الصلب، يمكن أن تفشل الحمض النووي ليصلب ويتوسع على الإطلاق. تحتاج متواليات المشعل ( التمهيدي ) أيضا أن يتم اختياره لتحديد فريد لمنطقة من الحمض النووي، وتجنب إمكانية تفويت-تهجين لتسلسل مماثل قريب. وهكذا صممت هذه البادئات باستخدام أدوات محددة، مثل برنامج التمهيدي اكسبرس (الحياة تكنولوجيز، كارلسباد، الولايات المتحدة الأمريكية)، أو غيرها. وهناك طريقة شائعة الاستخدام في تصميم التمهيدي تنطوي على بحث الانفجار, الذي هو أداة بحث في قاعدة بيانات بنك الجينات, حيث وينظر إلى كل من المناطق المحتملة التي يمكن للتمهيدي ( المشعل ) الربط بها. أيضا ينبغي تجنب تكرار في المشعلات, لأن تشكل حلقة قد يحدث, و التي يمكن أن تسهم في تفويت التهجين.
‐---------------------------------------------------------------------------------------
منقول من ويكبيديا
أحدث الصور 
موضوع: الجهاز المخبري PCR 
